小肠类器官慢速冷冻工艺的优化研究

贾淑芹; 曹裕坤; 胡叶静; 周新丽

doi:10.12465/issn.0253-4339.20260207002

您当前的位置：

首页 >

文章列表页 >

小肠类器官慢速冷冻工艺的优化研究

XXXX | 更新时间：2026-06-29

- 小肠类器官慢速冷冻工艺的优化研究
- Optimization of Slow-Freezing Protocols for Small Intestinal Organoids
- 制冷学报 2026年页码：1-10
- 作者机构：
  
  上海理工大学健康科学与工程学院生物系统热科学研究所上海 200093
- 作者简介：
  
  周新丽，女，教授，上海理工大学生物系统热科学研究所，13817547878，E-mail：zjulily@163.com。研究方向：低温生物医学技术。
- 基金信息：
- DOI：10.12465/issn.0253-4339.20260207002
  中图分类号： R318.52;Q813.1
- 收稿：2026-02-07，
  
  修回：2026-02-25，
  
  录用：2026-03-20，
  
  网络首发：2026-06-29，
- 稿件说明：
移动端阅览
贾淑芹，曹裕坤，胡叶静，等. 小肠类器官慢速冷冻工艺的优化研究［J］. 制冷学报，XXXX，XX（XX）：1-10.

Jia Shuqin，Cao Yukun，Hu Yejing，et al. Optimization of Slow-Freezing Protocols for Small Intestinal Organoids［J］. Journal of Refrigeration，XXXX，XX（XX）：1-10.
贾淑芹，曹裕坤，胡叶静，等. 小肠类器官慢速冷冻工艺的优化研究［J］. 制冷学报，XXXX，XX（XX）：1-10. DOI： 10.12465/issn.0253-4339.20260207002.

Jia Shuqin，Cao Yukun，Hu Yejing，et al. Optimization of Slow-Freezing Protocols for Small Intestinal Organoids［J］. Journal of Refrigeration，XXXX，XX（XX）：1-10. DOI： 10.12465/issn.0253-4339.20260207002.

摘要

小肠类器官在肠道生理研究与药物筛选中具有重要价值，但其冷冻保存技术常面临复苏存活率低、结构与功能受损等瓶颈。本文旨在通过引入冷冲击置核技术并优化降温参数，建立一种高效、稳定的小肠类器官慢速冷冻方案。在传统慢速冷冻工艺中引入置核环节，系统研究置核温度、冰晶生长阶段终点温度及降温速率对冻存效果的影响。通过检测复苏后的存活率评估冻存效果，采用H&E染色观察形态完整性、免疫荧光检测增殖标志物及连接蛋白，并利用RT-qPCR定量检测干性指标和多分化谱系的表达水平。置核技术显著提升了复苏效果，存活率从（85.05±3.06）%提升至（88.84±1.78）%，H&E显示置核后结构较完整。-8 ℃置核并以0.5 ℃/min的速度降温至-60 ℃，其存活率（89.02%±2.06%）显著优于传统降温盒组（83.11%±2.45%）。形态学和相关染色进一步证实，优化组类器官复苏后结构致密，增殖能力增强。同时，干性标志物、上皮连接蛋白及多谱系分化相关基因表达均显著上调，成功维持了全谱系分化潜能。置核技术通过主动诱导有序成核，有效降低了过冷度引起的机械损伤。优化后的工艺在存活率、结构完整性及生物学功能维持方面均优于传统方法，为类器官库构建及标准化应用提供了可靠技术方案。

Abstract

Objective

Small-intestinal organoids are highly valuable for intestinal physiological research and drug screening. However， their cryopreservation is often limited by low recovery rates as well as structural and functional damage. This study aimed to establish an efficient and stable slow-freezing protocol for small intestinal organoids by introducing controlled ice nucleation （seeding） and optimizing the key cooling parameters.

Methods

Focusing on slow-freezing， a seeding step was incorporated into the conventional protocol to investigate the effects of seeding temperature， terminal temperature for ice crystal growth， and cooling rate on cryopreservation outcomes. Evaluations included assessing survival rates， H&E staining for morphology， and immunofluorescence for proliferation markers and junction proteins. RT-qPCR was used to measure the expression of stemness and multilineage markers.

Results and Discussions

Seeding significantly enhanced post-thaw recovery， increasing viability from （85.05±3.06）% to （88.84±1.78）%， with H&E staining revealing better organoid architectural preservation. Parameter optimization identified an optimal protocol consisting of ice nucleation at -8 ℃ followed by cooling at 0.5 ℃/min to -60 ℃. This optimized regimen achieved a significantly higher survival rate （89.02%±2.06%） than the conventional passive cooling box method （83.11%±2.45%）. Morphological and immunostaining analyses demonstrated that recovered organoids exhibited compact structures and enhanced proliferation. Additionally， upregulated expression of stemness， epithelial junction integrity， and multilineage genes confirmed the effective preservation of their full-spectrum differentiation potential.

Conclusions

Seeding actively induces ordered ice nucleation， thereby reducing the mechanical damage caused by excessive supercooling. The optimized protocol outperforms traditional methods in survival， structural integrity， and biological function， thus providing technical support for organoid biobanking and standardized applications.

关键词

Keywords

references

Flood P ， Hanrahan N ， Nally K ， et al . Human intestinal organoids： Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology—current applications and limitations ［J］. European Journal of Immunology ， 2024 ， 54 （ 2 ）： 2250248 .

Zhou Li ， Luo Dan ， Lu Wei ， et al . Gastrointestinal tract organoids as novel tools in drug discovery ［J］. Frontiers in Pharmacology ， 2024 ， 15 ： 1463114 .

Thalheim T ， Siebert S ， Quaas M ， et al . Epigenetic drifts during long-term intestinal organoid culture ［J］. Cells ， 2021 ， 10 （ 7 ）： 1718 .

Almeqdadi M ， Mana M D ， Roper J ， et al . Gut organoids： mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease ［J］. American Journal of Physiology-Cell Physiology ， 2019 ， 317 （ 3 ）： C405 - C419 .

He Wanjuan ， Sun Qinlin ， Ge Dan ， et al . Application of nanomaterials in organoid culture and cryopreservation ［J］. Nanoscale Advances ， 2025 ， 7 （ 23 ）： 7483 - 7503 .

Rogulska O ， Havelkova J ， Petrenko Y . Cryopreservation of organoids ［J］. Cryoletters ， 2023 ， 44 （ 2 ）： 65 - 75 .

Lee B E ， Lee B J ， Lee K J ， et al . A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine ［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications ， 2022 ， 595 ： 14 - 21 .

zur Bruegge T F ， Liese A ， Donath S ， et al . Intestinal organoids in colitis research： focusing on variability and cryopreservation ［J］. Stem Cells International ， 2021 ， 2021 ： 9041423 .

Daily M I ， Whale T F ， Partanen R ， et al . Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation ［J］. Cryobiology ， 2020 ， 93 ： 62 - 69 .

Mazur P . Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing ［J］. The Journal of General Physiology ， 1963 ， 47 （ 2 ）： 347 - 369 .

John Morris G ， Acton E . Controlled ice nucleation in cryopreservation-A review ［J］. Cryobiology ， 2013 ， 66 （ 2 ）： 85 - 92 .

Dan N ， Shelake S ， Luo W C ， et al . Impact of controlled ice nucleation on intracellular dehydration， ice formation and their implications on T cell freeze-thaw viability ［J］. International Journal of Pharmaceutics ， 2024 ， 665 ： 124694 .

蒋沛，火晓越，刘宝林，等 . 细胞低温保存过程中冰晶成核的研究进展［J］. 制冷学报， 2020 ， 41 （ 2 ）： 159 - 166 .

Jiang Pei ， Huo Xiaoyue ， Liu Baolin ， et al . Ice nucleation during cell cryopreservation： a review ［J］. Journal of Refrigeration ， 2020 ， 41 （ 2 ）： 159 - 166 .

李维杰，宋立勇，刘宝林，等 . 超声波植冰对L-02肝细胞低温保存的影响［J］. 制冷学报， 2021 ， 42 （ 4 ）： 158 - 166 .

Li Weijie ， Song Liyong ， Liu Baolin ， et al . Effect of ultrasonic ice seeding on cryopreservation of L-02 hepatocyte ［J］. Journal of Refrigeration ， 2021 ， 42 （ 4 ）： 158 - 166 .

Lindinger B ， Mettin R ， Chow R ， et al . Ice crystallization induced by optical breakdown ［J］. Physical Review Letters ， 2007 ， 99 （ 4 ）： 045701 .

Dalvi-Isfahan M ， Hamdami N ， Xanthakis E ， et al . Review on the control of ice nucleation by ultrasound waves， electric and magnetic fields ［J］. Journal of Food Engineering ， 2017 ， 195 ： 222 - 234 .

Li Rui ， Yu Guanglin ， Azarin S M ， et al . Freezing responses in DMSO-based cryopreservation of human iPS cells： aggregates versus single cells ［J］. Tissue Engineering Part C： Methods ， 2018 ， 24 （ 5 ）： 289 - 299 .

Gao Yanan ， Bissoyi A ， Guo Qiongyu ， et al . Induced extracellular ice nucleation protects cocultured spheroid interior and exterior during cryopreservation ［J］. ACS Biomaterials Science & Engineering ， 2025 ， 11 （ 1 ）： 208 - 212 .

Murray K A ， Gao Yanan ， Griffiths C A ， et al . Chemically induced extracellular ice nucleation reduces intracellular ice formation enabling 2D and 3D cellular cryopreservation ［J］. JACS Au ， 2023 ， 3 （ 5 ）： 1314 - 1320 .

Nuytten G ， De Geest B G ， De Beer T . Relevance of controlled cooling and freezing phases in T-cell cryopreservation ［J］. Cryobiology ， 2024 ， 116 ： 104907 .

Nuytten G ， Revatta S R ， Van Bockstal P J ， et al . Development and application of a mechanistic cooling and freezing model of the spin freezing step within the framework of continuous freeze-drying ［J］. Pharmaceutics ， 2021 ， 13 （ 12 ）： 2076 .

Mazur P . Freezing of living cells： mechanisms and implications ［J］. American Journal of Physiology-Cell Physiology ， 1984 ， 247 （ 3 ）： C125 - C142 .

Sato T ， Vries R G ， Snippert H J ， et al . Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche ［J］. Nature ， 2009 ， 459 （ 7244 ）： 262 - 265 .

Körber C . Phenomena at the advancing ice–liquid interface： solutes， particles and biological cells ［J］. Quarterly Reviews of Biophysics ， 1988 ， 21 （ 2 ）： 229 - 298 .

McGann L E ， Farrant J . Survival of tissue culture cells frozen by a two-step procedure to -196 ℃. I. Holding temperature and time ［J］. Cryobiology ， 1976 ， 13 （ 3 ）： 261 - 268 .

Kilbride P ， Meneghel J ， Fonseca F ， et al . The transfer temperature from slow cooling to cryogenic storage is critical for optimal recovery of cryopreserved mammalian cells ［J］. PLoS One ， 2021 ， 16 （ 11 ）： e0259571 .

Mashouf P ， Tabibzadeh N ， Kuraoka S ， et al . Cryopreservation of human kidney organoids ［J］. Cellular and Molecular Life Sciences ， 2024 ， 81 （ 1 ）： 306 .

Han S H ， Shim S ， Kim M J ， et al . Long-term culture-induced phenotypic difference and efficient cryopreservation of small intestinal organoids by treatment timing of Rho kinase inhibitor ［J］. World Journal of Gastroenterology ， 2017 ， 23 （ 6 ）： 964 .

浏览量

下载量

CSCD

文章被引用时，请邮件提醒。

提交

工具集

关联资源

集中空调系统末端研究现状与展望

采用非共沸工质的联箱-小孔型气液分离单元实验研究

多联机系统低GWP制冷剂替代及润滑油技术发展

新能源商用车间接式热泵系统性能仿真及控制策略研究

除湿转轮的三维动态仿真与设计优化